الرئيسية التحكم التسجيل
 

 
 
العودة   منتديات الكيمياء الحيوية للجميع > الكيمياء الحيوية > تقنيات المعمل - Lab's techniques
 
 

تقنيات المعمل - Lab's techniques الخطوات المعملية و التقنيات و الاجهزه

إضافة رد
 
 
 
أدوات الموضوع انواع عرض الموضوع
 
 
 
 
قديم 04-10-2008, 02:38 AM   #1
دلـــــــ المدينة ــــوعة
ملك الكيمياء الحيوية للجميع
 
الصورة الرمزية دلـــــــ المدينة ــــوعة

 









دلـــــــ المدينة ــــوعة غير متواجد حالياً
افتراضي ماهـــــــــو Pcr ..!!

ما هو الـ PCR






كان اكتشاف اللولب الذهبي ((DNA من قبل العالمين واطسون وكريغ إنجازا علمياً كبيراً، مهد الطريق لإنجازات علميه أخرى في مجال الكيمياء الحيوية الجزيئية Molecular Biology ، توجت بوضع الخريطة الكاملة لصبغيات الخلية البشرية.

الحموض النووية هي جزئيات عضويه مكثورية Organic Polymers لعدد من النيوكليوتيدات Nucleotides مرتبطه فيما بينها بروابط ثنائية الاستر الفوسفاتي.

يتكون النيوكليوتيد من :

1- جزئ من السكر الخماسي (البنتوز Pentose)

2- جزئ من حمض الفوسفور

3- أساس آزوتي(البيورين Purine أو البيريميدين Pyrimidine )

إذا كان عدد النيوكليوتيدات قليلة، عرفت بالنيوكليوتيدات القليلة Oligonucleotides، أما إذا كان العدد كبيراً فيتشكل حينئذ DNAأو RNA.


RNA DNA

السكر الخماسي: الريبوز منقوص الاوكسجينDeoxyribose الريبوز Ribose

Pentose


البيورين: الادينين (A ) Adenine الادينين (A) Adenine

Purines الغوانين (G) Guanine الغوانين (G) Guanine


البيريميدين : السيتوزين (C) Cytosine السيتوزين (C) Cytosine

Pyrimidines

الثايمين (T) Thymine اليوراسيل (U) Uracil


الشكل: طاق مزدوج Double strand نتيجة طاق مفرد Single strand

Shape ارتباط الأسس الآزوتيه (C-G,T-A)

بروابط هيدروجينيه


التوضع : يوجد داخل نواة الخلية ويحمل المعلومات يوجد خارج النواة وداخلها

Location الوراثية


الوظائف:

1 – التنسخ Replication أي تكوين نسخة 1 – RNA الرسول m-RNA

Functions طبق الاصل من الجينوم للخلية البنت الحاملة (messengerRNA)

كل الصفات الوراثية للخليه الأم. يوضع داخل النواة كمتمم

2 – الانتساخ Transcription أي نقل جيني لنقل الراموز لصنع

المعلومات المرمزة على الجينوم إلى RNA البروتينات في هيولي الخلية

الرسول لصنع البروتينات في هيولي الخلية.

2- RNA الريبوز وهيr-RNA

(Ribosomal RNA)

يترجم الراموز المنقول عن طريق m-RNA في عملية صنع البروتينيات

3 – RNA الناقل t+RNA

( Transfer RNA)

ينقل الحموض الأمينية أثناء عملية صنع البروتينيات.


تفاعل البوليمراز السلسليPolymerase Chain Reaction (PCR)
تهدف تقنية PCR إلى تضخيم جزيئات قليلة من الحمض النووي DNA، بعد استخلاصه من خلايا أو سوائل الجسم وبالتالي الحصول على كميات كبيرة منه يمكن إجراء التحليل عليه. يمكن اعتبار تقنية PCR ترجمة مبسطة لعملية انتساخ الحمض النووي DNA أثناء الانقسام الخلوي.ولكي يتم هذا الانتساخ، لا بد من توفر مواد معينة تساعد على ذلك:

.1 البادئات Primers وهي عبارة عن نيوكلوتيدات قليلة Oligonucleotides (18 – 20 أساس آزوتي) قادرة على الارتباط مع الأسس الآزوتية للحمض النووي المراد تضخيمه، وذلك في منطقة ذات ترتيب مميز ونوعي غير متبدل للأسس الازوتية في الحمض النووي أو ما يعرف بمنطقة عالية الحفظ Highly Conserved Region .

.2 كميات وافرة من النيوكليوزيدات ثلاثية الفوسفات منقوصة الأوكسجين

(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)Deoxynuleoside triphosphates(dNTPs)

.3 أنظيم البوليميراز Polymerase مقاوم للحرارة المرتفعة، وأهمها Taq Polymerase المستخلص من بكتيريا تعيش في الينابيع الحارةThermus aquaticus.

.4 محاليل واقيه Buffers

.5 شوا رد مناسبة، أهمها شاردة المغنيزيوم Mg+2 التي تعتبر عامل متمم Cofactor لأنظيم البوليمراز.

تتألف تقنية PCR من ثلاث مراحل في دورة واحدة:

· مرحلة التمسخ الحراري Thermal denaturation لجزيءDNA الهدف، أي فصل الطاق المزدوج ds-DNA إلى طاقين منفصلين ss-DNA. وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 94 م .

· مرحلة تشفع البادئات Primers annealing، أي ارتباط كلا البادئتين مع الطاقين المنفصلين عند درجة حرارة 55م

· تطاول البادئات المتشفعة Annealed primers extension بمساعدة أنظم البوليمراز وذلك بإضافة dNTPs ابتداء من البادئة وفي الاتجاه 3← 5، وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 72 م.

تعاد هذه الدورة ذات الخطوات الثلاثة عدداً من المرات، مما يؤدي إلى زيادة جزيئات DNA بشكل أسي.

ويعطى عامل التضخيم بالمعادلة التالية = n ( 1+E )x ، حيثn = الكمية البدئية للحمض النووي الهدف

E = فعالية التضخيم ( (Efficiency

X = عدد دورات PCR

يمكن تطبيق تقنية PCR على الحمض النوويRNA بإجراء خطوه أولية وهي تكوين نسخة متممة من

ComplementaryDNA(cDNA)DNA

بواسطه انظيم الترنسكريتباز العكوسreverse transcriptase، ليخضعcDNA بعدها لمراحل التتضخيم السابقة.

وتعرف هذه التقنيةRT-PCR

يمكن الكشف عن منتجات التضخيم Amplicons بعدة طرق أهمها:

.1 الرحلان الكهربائي على هلامة الآغاروز Agarose Gel Electrophorsis .

.2 التهجين Hybridizationباستعمال مسابر موسومة بأنظيم Enzyme Labeled Probes

.3 استخدام بادئات موسومة بأنظيم أو مادة تألقية Enzyme Fluoresent Labeled Primers

.4 تقنية تعدد اشكال اطوال الشدف الحصريه

(RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism

.5 التنسيل Cloning

إن الحساسية العالية التي تبديها تقنية PCR، تجعلها عرضة لإعطاء نتائج إيجابية كاذبة بسبب تلوث خارجي المنشأ Contamination Exogenous. أهم مصادر هذا التلوث :

.1 التلوث بمنتجات تضخيم سابقة Carryover contamination

.2 التلوث من عينة أخرى Sample to sample contamination

لذا يعتبر التلوث العقبة الوحيدة المهمة التي تواجه استخدام تقنية PCR لغايات تشخيصية. يمكن تجنب التلوث بالانتباه لتفاصيل العمل المخبري بتقنيةPCR .لذلك تم الاعتماد على تقسيم مكان العمل إلى ثلاثة أقسام منفصلة عن بعضها بشكل تام:

.1 قسم الاستنهاض Extraction sector

.2 قسم تحضير الكواشفReagent preparation sector

) وهذان القسمان يعرفان بــــPre – PCR sector)

.3 قسم التضخيم والمعايرة Amplification + Detection sector

(ويعرف هذا القسم بــــ Post- PCR Sector )

هناك عدة تطبيقات لتقنية PCR : تداخلي Nested

لا تماثلي Asymmetric

تمايزي Differential

لكن أهمها تطبيقان:

.1 PCR التنافسي (Competitive PCR)، ويشكل المبدأ الرئيسي للمقايسة الكمية باستخدام مرصاف خارجي المنشأ Exogenous template كعياري داخلي. حيث يتنافس هذا العياري الداخلي Internal Standard و الحمض النووي الهدف على البادئات ذاتها اثناء عملية التضخيم، ثم تجرى المقايسة الكمية للناتجين باستخدام طرق مختلفة.

.2 PCR سريع الدورة ذي الوقت الواقعي Rapid Cycle Real- Time PCR، حيث امكن اجراء عملية التضخيم بدورة حرارية مدتها 20 – 60 ثانية، كماامكن تحليل منتجات عملية التضخيم أثناء عملية التضخيم باستخدام صبغات تألقية.

التطبيقات السريرية لتقنية PCR :

.1 الكشف المباشر للعامل الخمجي الممرض (جرثومي – فيروسي – طفيلي... ) قبل ارتكاس الجهاز المناعي لهذا العامل (إنتاج الأضداد). في الماضي، يتم الكشف عن العامل الممرض بشكل غير مباشر عن طريق كشف/ معايرة الأضداد:

- إيجابية كاذبة ← أضداد غير نوعية

- سلبية كاذبة ← تأخر ظهور / إنتاج الأضداد لأسباب مناعية.

وبشكل مباشر عن طريق الزرع ← صعوبة زرع الفيروسات

طول فترة الزرع كمال هي الحال في عصيات السل

.2 تحديد الحمل الفيروسي Viral Load وتحديد إمكانية المعالجة أم لا

.3 مراقبة وتقييم المعالجة :

PCR y ← استجابة

PCR Å ← عدم استجابة ← خطة علاجية جديدة

PCR y ثم Å في فترة المعالجة ← Break Through ← خطة علاجية جديدة

PCR y ثم Å بعد انتهاء المعالجة ← نكس

.4 تحديد الأنماط الجينية Genotyping للفيروس الكبدي C

.5 الأمراض الوراثية :

أ – كشف الأساس الجيني للمرض الوراثي عند الكاهل، ومعرفة الحاملين والمصابين ومن ثم المشورة الوراثية الصحيحة

ب – الكشف عنها قبل ظهور الأعراض والعلامات

ج – الكشف عنها عند الجنين أثناء الحمل، أو في حديثي الولادة

.6 تشخيص الأمراض السرطانية بالكشف الجيني للتوضع الغير طبيعي للأسس الآزوتية للجينات الورميه Oncogenes

.7 تعيين الأنماط النسيجية HLA- tissuc typing في مجال زراعة الأعضاء

.8 تلعب تقنية PCR دوراً هاماً في الطب الجنائي والشرعي.

أخيراً وليس أخرا، كانت تقنية PCR تستخدم في تسعينيات القرن الماضي كاختبارات استقصائية متممة، ولكن في نهاية القرن العشرين بدأت هذه التقنية تحل محل تقنيات كثيرة أخرى لأنها أثبتت فعالية كبيرة ودقة ممتازة.

وفي مطلع القرن الواحد والعشرين وبعد إتمام سلسلة الجينوم البشري، أصبح ينظر إلى كامل هذا القرن بأنه قرن الجينوميات Genomics وسيكون لتقنيةPCR دوراً أساسياً في هذه الثورة العلمية الكبرى.



من مواضيع دلـــــــ المدينة ــــوعة في المنتدى

التوقيع

   
رد مع اقتباس
 
 
 
 
قديم 04-30-2008, 12:23 AM   #2
ولد المدينه
مدير عام و عضو اللجنة الاعلامية
 
الصورة الرمزية ولد المدينه

 









ولد المدينه غير متواجد حالياً
افتراضي

الف شكر على الجهود

سلمت يداااك

دمت بووود



من مواضيع ولد المدينه في المنتدى

التوقيع

[flash=http://up.7cc.com/swf/7cc/b755657b18.swf]WIDTH=400 HEIGHT=120[/flash]

تسائل عن حصين كل راكب ...... وعند جهينة الخبر اليقين

فمن يك سائلاً عنه فعندي ...... لصاحبه البيان المستبين

جهينة معشري وهم ملوك ...... إذا طلبوا المعالى لم يهونوا
   
رد مع اقتباس
 
 
 
 
قديم 04-30-2008, 03:50 AM   #4
سونهام يغمور
Bioc سابقاً
 
الصورة الرمزية سونهام يغمور

 









سونهام يغمور غير متواجد حالياً
افتراضي

تجميعه حلوه منك لكن للاسف الموضوع مترجم عن نص انجليزي و الترجمه مو تمام

بس يعمل ريفريشن للناس اللى في بالي

بالذات حقت الادنين و الجوانين و الاشياء دي


يسلموا دلوعه



من مواضيع سونهام يغمور في المنتدى

التوقيع

..ادعموني هنا..
فيسبوك(FaceBook) -
مدونتي(soon)

::مواقعي الشخصية::


و اخيرا اتنشر بحث الماجستير
   
رد مع اقتباس
 
 
 
 
قديم 05-02-2008, 12:02 AM   #5
جــــــود
بيوكيميائي جديد
 
الصورة الرمزية جــــــود

 









جــــــود غير متواجد حالياً
افتراضي




من مواضيع جــــــود في المنتدى

التوقيع

   
رد مع اقتباس
 
 
 
 
قديم 06-13-2008, 09:38 PM   #8
Marwan Khattab
بيوكيميائي جديد

 









Marwan Khattab غير متواجد حالياً
Lightbulb

اقتباس:
المشاركة الأصلية كتبت بواسطة ولد المدينه مشاهدة المشاركة
الف شكر على الجهود

سلمت يداااك

دمت بووود
في دخولي الأول بعد قبولي عضواً اشكر كافة القائمين على رعاية هذا الموقع وجميع المساهمين في اغنائه بالمواضيع العلمية الحديثة والمفيدة.




   
رد مع اقتباس
 
 
إضافة رد


الذين يشاهدون محتوى الموضوع الآن : 1 ( الأعضاء 0 والزوار 1)
 
أدوات الموضوع
انواع عرض الموضوع

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك

BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة

الانتقال السريع



الساعة الآن 02:57 AM


Powered by vBulletin® Version 3.8.7
Copyright ©2000 - 2024, vBulletin Solutions, Inc.
يوتك